El blog sobre Principios clave y solución de problemas para los kits de extracción de ácidos nucleicos

La extracción de ácidos nucleicos sirve como piedra angular de los experimentos de biología molecular.Muchos investigadores se encuentran perplejos, especialmente cuando se resuelven problemas con resultados inesperados. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, un proceso eficiente.

La mayoría de los kits comerciales de extracción de ácidos nucleicos utilizan la tecnología de columna de espín de membrana de sílice, con cinco etapas críticas: lisis celular, unión de ácidos nucleicos, lavado y purificación, secado,y la elución finalCada paso se basa en el anterior, lo que significa que cualquier paso en falso puede comprometer toda la extracción.

Las formulaciones de amortiguador de lisis varían según se extraiga ADN o ARN,pero suelen contener altas concentraciones de sales caotrópicas que tienen dos propósitos:

• Desnaturación de las proteínas:Estas sales interrumpen los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrófobas, desestabilizando las proteínas (incluidas las nucleasas) para evitar la degradación del ácido nucleico.
• Facilitar la unión de la sílice:Los caótropos desplazan las moléculas de agua de los ácidos nucleicos, creando condiciones óptimas para la transferencia a las membranas de sílice.

Las sales caotrópicas comunes incluyen el clorhidrato de guanidina, tiocyanato de guanidina, urea y perclorato de litio.Dependiendo del tipo de muestraLa proteína K digiere eficazmente las proteínas en las preparaciones de ácidos nucleicos, particularmente en condiciones de desnaturalización.aunque su actividad disminuye en condiciones de desnaturación.

La extracción de plásmidos difiere significativamente del aislamiento de ARN o ADN genómico.Agregar sales caotrópicas inmediatamente liberaría todos los tipos de ADN indiscriminadamentePor lo tanto, los protocolos de plásmidos suelen introducir caótropos después de la lisis celular inicial.

Más allá de la lisis, las sales caotrópicas facilitan la unión de ácidos nucleicos a las columnas de sílice.Las columnas de sílice contienen resina que se une selectivamente al ADN o ARN dependiendo de la concentración de sal y otros factoresLos ácidos nucleicos resultantes presentan una alta pureza adecuada para la clonación, la secuenciación de lectura larga y otras aplicaciones.

El exceso de etanol precipita material degradado y pequeñas moléculas, afectando las lecturas de absorbancia de A260.El etanol insuficiente puede impedir la eliminación de sal de las membranasLos volúmenes de etanol proporcionados por el kit están pre-optimizados, pero si el ADN degradado parece sesgar las lecturas de A260, la re-optimización de la concentración de etanol puede ayudar.Las soluciones de flujo se pueden guardar para la precipitación para recuperar los ácidos nucleicos perdidosCuando los detergentes que contienen SDS se utilizan en la lisis, el NaCl sirve como un precipitante eficaz que evita la contaminación del detergente.

Después de centrifugar el lisato a través de membranas de sílice, los ácidos nucleicos objetivo se unen a las columnas mientras que las proteínas y los polisacáridos permanecen en flujo.las membranas retienen proteínas y sales residualesLas muestras de plantas pueden dejar polisacáridos y pigmentos; las muestras de sangre a menudo producen una decoloración marrón o amarilla.

El primer lavado suele contener bajas concentraciones de chaotrópicos para eliminar proteínas y pigmentos residuales.seguido de un lavado con etanol para eliminar las salesLas muestras inicialmente bajas en proteínas (por ejemplo, preparaciones de plásmidos o purificación de productos PCR) pueden requerir solo un lavado con etanol.Algunos kits recomiendan el lavado doble con etanol.Las sales residuales inhiben la elución, reduciendo los rendimientos y aumentando las lecturas de A230 que deprimen las proporciones de A260/230.

La mayoría de los protocolos incluyen la centrifugación posterior al lavado para secar el etanol residual de las columnas.Se añade 10 mM de Tris o agua y luego se rehidratan los ácidos nucleicos para liberar la membrana.El etanol residual impide la rehidratación y la elución completa.Los signos reveladores incluyen que las muestras no se depositan en los pozos de gel de agarosa (incluso con un colorante de carga presente) o que no pueden congelarse a -20 °C..

El paso final de extracción del ADN libera ácidos nucleicos puros de sílice. Para el ADN, 10 mM Tris a pH 8-9 es estándar.El ADN se mantiene más estable en un pH débilmente alcalino y se disuelve más rápido en el tampón que en el agua. Incluso los precipitados de ADN se comportan de manera similar. El agua suele mostrar un pH más bajo (4-5), y el ADN de alto peso molecular puede no rehidratarse completamente rápidamente.dejar que el amortiguador se asiente en las membranas durante varios minutos antes de la centrifugaciónPara aplicaciones que requieren un ADN de alto peso molecular intacto (por ejemplo, secuenciación de lectura larga), los búferes de elución son óptimos.haciendo del agua el diluyente preferido.

Incluso siguiendo los protocolos estándar, las extracciones pueden encontrar varios problemas:

• Bajo rendimiento:A menudo se debe a una lisis incompleta o a condiciones de unión subóptimas.El etanol de mala calidad o viejo puede absorber la humedadRecuerde que los amortiguadores de lavado mal preparados pueden eliminar los ácidos nucleicos extraídos.
• Baja pureza:La contaminación de proteínas es a menudo el resultado de un material de partida excesivo que aumenta el riesgo de disolución incompleta.Utilice etanol de la más alta calidad para los tampones de lavado, y si los problemas persisten, añadir pasos de lavado adicionales.
• Contaminantes:Las muestras ambientales resultan particularmente susceptibles a sustancias húmicas que se copurifican con el ADN y resisten la eliminación de la columna de sílice.Las técnicas especializadas pueden eliminar las proteínas y los húmicos que interfieren antes de la unión de la columna.
• Descomposición:El ARN se enfrenta a mayores riesgos de degradación, típicamente por el almacenamiento inadecuado de la muestra o la lisis ineficiente (suponiendo que se use agua libre de RNasa).La degradación es menos importante para las aplicaciones de PCR, pero se vuelve crítica para la secuenciación de lectura larga que requiere un ADN de alto peso molecular intacto !
• Purificación del producto de PCR:Aunque no es estrictamente extracción de ADN, esto merece mención.Las purificaciones fallidas generalmente se derivan de la PCR fallida, pero ahorrar el flujo es prudente si las bandas de PCR transparentes no se unen a las columnas, es probable que permanezcan en flujo para la recuperación y re-purificación.

La lisis incompleta puede manifestarse como rendimientos inesperadamente bajos, disolución incompleta de proteínas o malas proporciones de A260/230.Esto sugiere que ciertos componentes de la muestra no se lisan o disuelven completamente durante la extracción.Para distinguir la lisis incompleta de la contaminación o degradación se requiere un análisis cuidadoso de las condiciones de extracción, incluida la composición del tampón de lisis, los parámetros de incubación,y sustancias potencialmente interferentesPor ejemplo, las malas proporciones de A260/230 pueden indicar sales residuales después de la unión o un lavado insuficiente en lugar de una lisis incompleta.El tratamiento de la lisis incompleta puede requerir la optimización de los componentes del búfer de lisis., los tiempos de incubación o incorporando métodos de lisis mecánica/enzimática adicionales.

Las técnicas especializadas apuntan a la eliminación de sustancias húmicas y otros interferentes que pueden copurificar con ácidos nucleicos de las muestras ambientales.Estos incluyen amortiguadores de extracción especializados que contienen agentes quelantes (e.g..g., EDTA) para la unión y eliminación selectiva de cationes.Los métodos de pretratamiento como la centrifugadora diferencial o la filtración pueden ayudar a eliminar partículas más grandes de las muestras ambientales antes de la extracción de ácidos nucleicos., reduciendo las interferencias durante los pasos de unión.

Algunas muestras (por ejemplo, tejidos o materiales ricos en lípidos) presentan desafíos específicos.Las muestras de tejido a menudo requieren una interrupción mecánica adicional o una digestión enzimática para garantizar la lisis completa y la liberación de ácido nucleico.Las muestras ricas en lípidos pueden complicar la purificación ya que los lípidos pueden interferir con la unión de ácidos nucleicos a las matrices de columna.optimización de los protocolos de purificación, o utilizando kits especialmente diseñados.

Publicado originalmente el 28 de junio de 2010.