¿Alguna vez se ha confundido con los términos "PCR", "RT-PCR" y "qPCR" en el laboratorio?Ayudarle a navegar en su investigación de manera más efectiva.
PCR: La "fotocopiadora" del ADN
La PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, funciona como una "fotocopiadora" de ADN.producen millones a miles de millones de copias en cuestión de horasLa PCR es esencial para la clonación de genes, secuenciación de ADN, diagnóstico de enfermedades y numerosas otras aplicaciones.
El proceso de PCR consiste en tres pasos repetitivos que permiten la amplificación exponencial del ADN:
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Las demás:La alta temperatura (94-98°C) separa el ADN de doble hebra en hebras simples.
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Anulación:La reducción de la temperatura (50-65°C) permite que los primers se unan a secuencias de diana complementarias.
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Extensión:La ADN polimerasa (típicamente Taq polimerasa) sintetiza nuevas hebras complementarias a 72 °C.
Después de 25-40 ciclos, el ADN amplificado se puede visualizar mediante electroforesis de gel de agarosa.
qPCR: La "fotocopiadora" de monitoreo en tiempo real
La PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiempo real se basa en la PCR convencional al incorporar la detección de fluorescencia para monitorear la amplificación en tiempo real mientras se cuantifica la cantidad inicial de plantilla de ADN.
Existen dos métodos de detección de fluorescencia primaria:
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Colocantes que se unen al ADN (por ejemplo, verde SYBR):Es rentable pero no específico, se une a todo el ADN de doble cadena.
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Las sondas fluorescentes:Específico al objetivo pero más caro, requiere sondas diseñadas a medida.
La métrica clave de qPCR es el valor Ct (ciclo umbral) el número de ciclos cuando la fluorescencia excede un umbral definido.
Las aplicaciones incluyen:
- Análisis de la expresión génica
- Detección de patógenos
- Control de drogas
- Investigación del cáncer
RT-PCR: El ARN "fotocopiadora"
La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) convierte primero el ARN en ADN complementario (ADNc) utilizando la transcriptasa inversa, luego amplifica el ADNc a través de la PCR estándar. Esto permite el análisis del ARN, incluyendo:
- Estudios de expresión génica
- Detección de virus de ARN (por ejemplo, VIH, influenza)
- Investigación de la estructura/función del ARN
RT-qPCR: El sistema de cuantificación del ARN
La RT-PCR cuantitativa en tiempo real combina la transcripción inversa con la qPCR para cuantificar los niveles de expresión del ARN.
- Medición precisa de la expresión génica
- Cuantificación del microARN
- Estudios largos de ARN no codificante
Análisis comparativo
| Características |
PCR |
QPCR |
RT-PCR |
RT-qPCR |
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Modelo de información
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El ADN |
El ADN |
El ARN |
El ARN |
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Objetivo
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Amplificación del ADN |
Cuantificación del ADN |
ARN→cADN→ADN |
Cuantificación del ARN |
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Detección
|
Electroforesis por gel |
Fluorescencia |
Electroforesis por gel |
Fluorescencia |
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Cuantitativo
|
- No, no lo sé. |
- ¿ Qué? |
- No, no lo sé. |
- ¿ Qué? |
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Principales aplicaciones
|
Clonado, secuenciación |
Análisis de expresiones, diagnóstico |
Detección de virus de ARN |
Estudios de expresión génica |
Consideraciones técnicas
Diseño del primer/sonda
La qPCR requiere primeras y sondas cuidadosamente diseñadas para garantizar la especificidad.
Selección de la transcriptasa inversa
Diferentes enzimas (por ejemplo, AMV, M-MLV) varían en estabilidad térmica y eficiencia, lo que afecta el rendimiento del cDNA.
Evitar los artefactos
La amplificación no específica se puede minimizar a través de temperaturas de recocido optimizadas y polimerasas de alta fidelidad.
Comprender las diferencias entre estas técnicas moleculares permite a los investigadores seleccionar métodos adecuados para sus necesidades experimentales específicas, asegurando resultados precisos y confiables.
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