Interpretación de los Principios de las Pruebas RTPCR y el Riesgo de COVID19

A medida que la pandemia de COVID-19 continúa presentando desafíos globales, las pruebas RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa) siguen siendo el estándar de oro para diagnosticar la infección por SARS-CoV-2. Pero, ¿cuántos entienden realmente los principios científicos detrás de esta crucial herramienta de diagnóstico? Este artículo proporciona una explicación detallada pero accesible de las pruebas RT-PCR, ayudando tanto a los profesionales médicos como al público en general a comprender mejor esta tecnología vital.

La RT-PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa en Tiempo Real, es una técnica de biología molecular altamente sensible y rápida utilizada para detectar material genético específico en muestras. Este material genético puede originarse de humanos, bacterias o virus como el SARS-CoV-2.

La tecnología central detrás de la RT-PCR es la PCR, inventada por Kary B. Mullis en la década de 1980 (lo que le valió un Premio Nobel). La PCR amplifica y detecta objetivos específicos de ADN. Mejoras posteriores permitieron la visualización y cuantificación "en tiempo real" de los objetivos de ADN durante la amplificación. En la PCR en tiempo real, la intensidad de fluorescencia de sondas especializadas se correlaciona con la cantidad de ADN amplificado.

Sin embargo, la PCR estándar solo detecta ADN. Dado que el SARS-CoV-2 contiene material genético de ARN, la prueba requiere la enzima transcriptasa inversa para convertir el ARN en ADN complementario (ADNc). Este paso de transcripción inversa, combinado con la PCR en tiempo real, convierte a la RT-PCR en una herramienta poderosa para detectar virus de ARN como el SARS-CoV-2.

Comprender la RT-PCR requiere conocimientos básicos del material genético, el manual de instrucciones que rige el comportamiento celular y viral, la supervivencia y la reproducción. El material genético se presenta en dos formas principales: ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico). El ADN presenta una estructura de doble cadena, mientras que el ARN es de cadena simple. Para fines de diagnóstico, la mayor estabilidad del ADN lo hace preferible para las pruebas de enfermedades infecciosas. Cabe destacar que el SARS-CoV-2 contiene solo ARN.

Todos los virus comparten la característica de depender de las células huésped para sobrevivir y replicarse. El SARS-CoV-2, como otros virus, invade células sanas para reproducirse. Cuando ocurre la infección, el virus libera su ARN y secuestra la maquinaria celular para la replicación. Mientras el material genético viral permanezca en las células, la RT-PCR puede detectar la infección por SARS-CoV-2.

Los trabajadores de la salud capacitados recolectan muestras de hisopos nasofaríngeos, que luego se colocan en tubos estériles que contienen un medio de transporte viral para preservar la integridad viral.

En el laboratorio, los investigadores extraen el ARN utilizando kits comerciales de purificación. Luego, la muestra de ARN se agrega a una mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para la prueba, incluyendo ADN polimerasa, transcriptasa inversa, bloques de construcción de ADN y sondas y cebadores fluorescentes específicos para el SARS-CoV-2.

Dado que la PCR solo funciona con plantillas de ADN, la transcriptasa inversa convierte todo el ARN en la muestra (incluido el ARN humano, bacteriano, de otros coronavirus y, potencialmente, el ARN del SARS-CoV-2) en ADNc.

Este proceso implica tres pasos repetidos:

• Desnaturalización: Calentar el ADN a >90°C durante unos 10 minutos separa el ADN de doble cadena en cadenas simples.
• Alineación de Cebadores: Fragmentos cortos de ADN (cebadores) especialmente diseñados se unen a objetivos específicos de ADNc del SARS-CoV-2 a temperaturas más bajas. Los objetivos genéticos comunes de COVID-19 incluyen la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), ORF1ab, gen S (proteína de pico), gen N (nucleocápside) y gen E (envoltura).
• Extensión: La ADN polimerasa utiliza cebadores como puntos de partida para crear copias idénticas de segmentos de ADN objetivo.

El proceso se repite típicamente 40 veces, duplicando el ADN objetivo con cada ciclo. Las sondas fluorescentes se unen aguas abajo de los cebadores, liberando señales detectables con cada amplificación de ADN. El aumento del ADN objetivo se correlaciona con el aumento de la intensidad de la fluorescencia.

Los datos de fluorescencia generan un valor de "Umbral de Ciclo" (Ct), el número de ciclos necesarios para que la señal exceda los niveles de fondo. Las muestras con más ADN objetivo se amplifican más rápido, requiriendo menos ciclos (valores Ct más bajos). Por el contrario, el ADN objetivo escaso requiere más ciclos (valores Ct más altos).

Los valores Ct proporcionan información crucial sobre la carga viral. Los valores Ct más bajos indican cantidades más altas de genoma viral, mientras que los valores más altos sugieren cantidades más bajas. Los proveedores de atención médica combinan los valores Ct con los síntomas clínicos y la historia para evaluar la etapa de la enfermedad. Los valores Ct seriados de pruebas repetidas ayudan a monitorear la progresión de la enfermedad y predecir la recuperación. Los rastreadores de contactos también utilizan los valores Ct para priorizar a los pacientes con las cargas virales más altas (y, por lo tanto, el mayor riesgo de transmisión).

• Carga Viral: Los valores Ct se correlacionan inversamente con la carga viral: un Ct más bajo significa que hay más virus presente.
• Etapa de la Enfermedad: La infección temprana típicamente muestra altas cargas virales (Ct bajo), mientras que las etapas posteriores muestran cargas en declive (Ct en aumento) a medida que el sistema inmunológico elimina la infección.
• Riesgo de Transmisión: Cargas virales más altas (valores Ct más bajos) indican un mayor potencial de transmisión, lo que justifica medidas de aislamiento más estrictas.

A pesar de ser el estándar de oro de diagnóstico de COVID-19, la RT-PCR tiene limitaciones:

• Falsos Negativos: La toma de muestras incorrecta, las bajas cargas virales o las pruebas tempranas pueden producir resultados negativos a pesar de la infección real.
• Falsos Positivos: Resultados positivos raros pero posibles sin infección real.
• Desafíos de Estandarización: Diferentes laboratorios y plataformas pueden usar diferentes umbrales de Ct, lo que complica las comparaciones.

Las pruebas RT-PCR siguen siendo esenciales para el diagnóstico de COVID-19 al detectar material genético del SARS-CoV-2. Los valores Ct sirven como indicadores vitales de la carga viral, la progresión de la enfermedad y el riesgo de transmisión. Sin embargo, las limitaciones de las pruebas requieren la combinación de los resultados con la evaluación clínica para un diagnóstico y manejo precisos.